Step1：细胞健康状态

细胞的状态会直接影响你的实验结果。若你因为愉快过周末而把细胞遗忘在培养箱的角落，或平日里照顾不周，细胞极可能会突变成多核细胞、形成应激颗粒、遭到支原体污染或出现死亡细胞碎片（见下图）。

Step2：细胞融合度

有时候我们需要观察高密度培养的细胞信号，比如使用ZO-2观察紧密连接。然而，如果细胞密度过高，视野中无可界定的边缘，所拍摄的图片将不具说明意义。另一方面，如果细胞密度过低，你能选择拍摄的视野就会非常有限。

Step3：一抗的选择

选择严格验证应用于IF的抗体必然会使得实验更加顺畅。只有图片产生前的所有验证工作（抗体滴度、步骤优化等）都准确无误，你才能得到最好的结果。用高通量分析软件生成的灰度图片有利于比较平板中抗体的信号强度（左）。单色或双色图片有助于我们确定抗体最佳稀释比（中）。前面的分析确保我们得到的三色图片能够很好的反映我们感兴趣的目的蛋白（右）。

Step4：二抗和复染剂

我们经常使用 AlexaFluor^® 488 偶联二抗 (或直接连有AlexaFluor^® 488的抗体) 来检测我们感兴趣的蛋白靶点，因为绿色荧光的视觉冲击性很强。同时，复染剂和DNA染料的选择应以凸显抗体染色且不增加背景为原则。

Step5：视野和放大倍数的选择

尽量选择细胞数量合适的视野（我们一般选择细胞数量大于3的区域）来显示抗体的着色，如果染色的异质性较强，则要确保所选取区域能够展示这一点。如果为了扩大范围而过于缩小放大倍率，就会看不清亚细胞定位（如有丝分裂和黏着斑）。

任何技术都是熟能生巧。您进行的荧光染色实验越多，操作就越自如，获得的图像质量也会越好。只要能获得想要的图像，即使是寻遍每一块区域也是值得的。祝您好运，愿您总能获得想要的荧光图！