对于抗体，都是由厂家内部研发生产并且经过多重交叉验证之后才提供给客户的，厂家尽全力保证出厂的抗体都具有高灵敏度、高特异性、高度可重复性。如果您用抗体出现多条非特异性条带，除了考虑一抗的因素，还需要考虑以下几个因素：

. 1 .

原因：细胞系传代次数过多，蛋白表达谱发生变化。

建议：使用未传代或传代次数较少的细胞系（不超过15代）进行样品制备。

. 2 .

原因：与细胞系裂解物相比，原代细胞或组织提取物会倾向于有较高的背景和降解条带。

1. 用新鲜提取的，经过超声处理的澄清的组织提取物能降低背景。

2. 同时，用去垢剂含量较高的RIPA buffer裂解组织，可得到裂解更彻底、一致性更高的裂解物。

. 3 .

原因：蛋白被降解。

建议：1. 提取液确保含有蛋白酶抑制剂，并超声；

2. 蛋白样品提取后分装－20℃或－80℃短期保存，避免反复冻融，有条件尽量用新鲜提取的蛋白。

. 4 .

原因：蛋白本身有很多修饰。

建议：查阅文献，确定目的蛋白是否存在多种修饰，泛素化、糖基化等修饰会让蛋白的条带发生较大的偏移。

. 5 .

原因：所检测蛋白存在多种剪接体，导致分子量大小不同。

建议：查阅文献或者通过搜索数据库来确定该蛋白是否存在多种长度不同的编码mRNA。

. 6 .

原因：蛋白存在二聚体或多聚体。

建议：SDS loading buffer中现用现加β－巯基乙醇或DTT。

. 7 .

原因：样本存在外源转入蛋白。

建议：检查所用样本是否有过被外源进去带有标签的靶标蛋白。如有，更换细胞系样本。

. 8 .

原因：上样量过多。

建议：根据靶标表达情况，梯度上样跑胶后选择合适的上样量，通常20-50µg即可。

. 9 .

原因：实验操作与推荐的步骤有较大出入。

1. 一般推荐封闭液用5%脱脂奶粉／TBST，室温1h；

2. 一抗稀释液、稀释比参考抗体说明书，推荐4℃过夜孵育；

3. 二抗用5%脱脂奶粉／TBST稀释，工作浓度切忌过高，室温孵育1h；

4. 要用1XTBST缓冲液充分洗涤。

 

 

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